Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Antonio SECCHI Libera Università “Vita Salute S.Raffaele” MILANO
Obiettivo del Programma di Ricerca
Il diabete di tipo I è una malattia autoimmune caratterizzata dalla distruzione delle cellule che producono insulina da parte di cellule citotossiche. Il diabete di tipo I è difficile da controllare con le terapie attualmente disponibili.
Conseguentemente i pazienti possono patire conseguenze molto gravi tra le quali la malattia cardiovascolare accelerata, una vascolopatia periferica, la nefropatia, retinopatia, neuropatia. L’incidenza del diabete di tipo I è in aumento in tutto il mondo. Sebbene la malattia possa esordire ad ogni età, nella maggior parte dei casi insorge entro i 20 anni di età. In alcune popolazioni circa 1% di tutti i bambini è destinato a sviluppare il diabete durante la sua vita.
Il trapianto di Isole come terapia del diabete di tipo I è stato un importante obbiettivo della ricerca Biomedica.
Si sono infatti osservati significativi progressi nel corso di questi ultimi anni. In particolare il successo del “protocollo di Edmonton” per il trapianto di isole nel portare la insulina indipendenza a pazienti affetti da diabete di tipo I ha dimostrato che il trapianto di isole è una terapia disponibile per quei pazienti nei quali la malattia non possa essere effettivamente gestita con i metodi attuali di terapia. Importanti ostacoli devono essere comunque affrontati per lo sviluppo definitivo del trapianto di isole come cura del diabete di tipo I nella popolazione generale. Tra questi i più importanti sono la tossicità associata con terapie immunosoppressive attuali, una adeguata tecnica di isolamento delle isole e il limitato numero di donatori cadaveri disponibili per isole.
I recenti successi raggiunti nel trapianto di isole, in tremini di controllo metabolico (Ryan Diabetes) e di impatto su nefropatia e microangiopatia (fiorina (JASN, Diabetes Care) inducono ad un ulteriore impegno nella ricerca che consenta lo sviluppo di metodi per ottenere un numero illimitato di isole per trapianto, il miglioramento dei metodi per il prelievo dei pancreas di isolamento delle isole, il miglioramento delle tecniche per la somministrazione delle isole da trapiantare, il miglioramento del’engraftment e della sopravvivenza delle isole dopo trapianto, lo sviluppo di approcci che riducano al minimo a tossicità della terapia immunosoppressiva in questi pazienti.
L’interesse internazionale delle agenzie di finanziamento delle ricerche in questo campo è confermato dalla politica dell’ITN (Immune Tollerance Network) e dai recenti annunci del NIH (14 milioni di dollari americani per il trapianto di isole).
Lo scopo di questo Progetto, che e’ il proseguimento di un precedente progetto, finanziato dal MIUR nel 2002 (Prot. 2002067482), è il raggiungimento di alcuni obbiettivi. Come segue:
Trial clinico
– Eseguire trapianti di insule nell uomo, applicando il protcollo di Edmonton, dopo condizionamento dei pazienti con Rapamicina per almeno 30 giorni prima del trapianto (Unita 6)
– Studiare gli effetti del trapianto di isole sulla fisiologia del miocardio nel uomo (Unita 6)
Stdui meccanicistici su engraftment e vitalita’ delle isole, apoptosi ed reattivita’ immune:
– sviluppare un sistema di rivascolarizzazione delle insule trapiantate che ripristini rapidamente le caratteristiche anatomo-funzionali dell’endotelio insulare e incrementi le possibilità di attecchimento delle insule nel tessuto ospite. Il nostro approccio si basa sulle recenti acquisizioni sulla capacità di cellule progenitrici endoteliali (EPCs) circolanti di rivascolarizzare tessuti ischemici o organi trapiantati e si propone di valutarne le potenzialità come strategia di rigenerazione dell’endotelio insulare. (Unita 3)
– studiare le variazioni metaboliche nel processo ontogenetico della beta cellula pancreatica mediante spettroscopia NMR (Metabonomica) (Unita 4)
– analizzare il proteoma delle cellule del dotto pancreatico e delle beta cellule di derivazione duttale. (Unita 4)
– Analizzare l’espressione, attività e regolazione delle molecole apoptosi-correlate nelle cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) sia in condizioni basali che dopo trattamento con citochine proinfiammatorie o altri induttori di apoptosi (NO), in pazienti T1DM che presentano resistenza o meno all’apoptosi (Unita 5)
– analizzare le variazioni della permeabilità mitocondriale e altri segni di danno mitocondriale collegato con processi apoptotici in PBMC provenienti da pazienti T1DM che presentano o meno resistenza all’apoptosi. (Unita 5)
– analizzare le citochine circolanti e dei linfociti Th1 e Th2 provenienti da sangue periferico o infiltranti le insule pancreatiche di pazienti T1DM che presentano resistenza o meno all’apoptosi. (Unita 5)
– analizzare l’espressione, dell’attività e della regolazione delle molecole correlate all’apoptosi nelle insule pancreatiche, sia in condizioni basali che dopo trattamento con citochine proinfiammatorie o altri induttori di apoptosi (Unita 5)
Xenotrapianto
– Validare i trapianti di strutture insulari microincapsulate in alginato/poliornitina (AG/PLO) in riceventi diabetici non immunosoppressi, sia a livello clinico – allotrapianti di insule umane in pazienti con T1DM-, che pre-clinico – xenotrapianti di insule neonate e cellule staminali pancreatiche suine in animali superiori (cani e primati sub-umani). (Unita 2)
– sviluppare un sistema di co-coltura in vitro delle insule con cellule di sertoli volto ad aumentare la vitalità a la funziona insulare prima del trapianto. (Unita 1)
– proseguire gli studi precedentemente iniziati atti ad aumentare la funzionalità e la vitalità delle insule sviluppando una strategia combinata antiapoptotica, anticoagulante e con capacità inibitorie sul complemento. . (Unita 1)
– Applicare tali strategie in modelli in vivo, utilizzando inizialmente un modello di topi trimerici e, successivamente, un modello di xenotrapianto in primati non umani . (Unita 1)
Risultati parziali attesi
Con questo progetto ci aspettiamo di poter sviluppare il trapianto di isole nel paziente diabetico, espandendo le sue indicazioni e meglio definendo i suoi potenziali limiti. Una miglior definizione dei risultati metabolici e dei potenziali effetti collaterali di questa procedura e’ indispensabile per un suo sviluppo.
I risultati sull’ impatto del trapianto sulla micardiopatia diabetica ci consentiranno di approfondire le conoscenze di questa malattia invalidante e di esportare questi risultati ad altre terapie del diabete.
Con gli studi meccanicistici ci aspettiamo di sviluppare un sistema di rivascolarizzazione delle insule trapiantate che ripristini rapidamente le caratteristiche anatomo-funzionali dell’endotelio insulare e incrementi le possibilità di attecchimento delle insule nel tessuto ospite.
Il nostro approccio si basa sulle recenti acquisizioni sulla capacità di cellule progenitrici endoteliali (EPCs) circolanti di rivascolarizzare tessuti ischemici o organi trapiantati e si propone di valutarne le potenzialità come strategia di rigenerazione dell’endotelio insulare. Inoltre I risultati di questo progetto di ricerca arricchiranno le conoscenze sulle basi molecolari delle vie biochimiche che portano all’apoptosi e sull’immunoregolazione periferica che potrebbe avere una influenza tanto nella risposta infiammatoria (insulite) tipica del diabete quanto nella cinetica dello sviluppo del diabete di tipo autoimmune.
Una più approfondita conoscenza dei meccanismi molecolari e delle vie di trasduzione del segnale che regolano il ” pathway” apoptotico o di resistenza all’apoptosi da parte di linfociti o delle b cellule pancreatiche potrà essere di ausilio per un più razionale utilizzo degli approcci terapeutici volti a regolare le difese dell’ospite durante il diabete autoimmune di tipo I ed il trapianto di insule pancreatiche
Nel settore dello xenotrapianto ci aspettiamo di realizzare alcuni obbiettivi:
1) Conseguire una “proof of principle” per l’impiego di insule microincapsulate nell’uomo. Ad onta degli studi eseguiti nell’arco degli ultimi 25 anni, anche nel nostro laboratorio, non si è finora dimostrato che allotrapianti di insule microincapsulate possano funzionare in pazienti con T1DM non immunosoppressi. Dato il carattere pionieristico dello studio, è prevedibile che sarà comunque rilevante il bagaglio di nuove informazioni, qualsivoglia sia il risultato ottenuto.
2) alternativa a quella umana (suino neonato). Prevediamo che il costante progresso conseguito dal nostro laboratorio nella biologia delle insule suine neonate, ci consenta di sviluppare un prototipo stabile di tali aggregati cellulari, che lo rendano idoneo, previo microincapsulamento al trapianto.
3) Generare un prototipo di cellula staminale pancreatica suina orientata in senso endocrino B, che si presti a sostituire le insule umane. Apprenderemo informazioni rilevanti sui tipi cellulari intermedi, inclusi prodotti di trascrizione genica, che mediano la transdifferenziazione di cellule duttali pancreatiche in cellule B-simili in grado di sintetizzare insulina endogena. Prevediamo di continuare a sviluppare prototipi cellulari sempre più vicini alle B-cellule, fino al loro possibile impiego in sistemi di trapianto.
Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
Lo scopo di questo Progetto è di sviluppare il trapianto di isole nei pazienti diabetici di tipo I attraverso 3 linee:
sviluppo di trias clinici
studimeccanicistici sull’ engraftment, apoptosi e reattività immunologia
potenzialita’ dello xenotrapianto
Questo è il proseguimento di un precedente progetto, finanziato dal MIUR nel 2002 (Prot. 2002067482).
1 – SVILUPPO DEL TRAPIANTO DI ISOLE NEI PAZIENTI DIABETICI DI TIPO I NON UREMICI
Dopo il I trapianto i pazienti che ricevono il trapianto di isole secondo il Protocollo di Edmonton mostrano una riduzione del fabbisogno insulinico del tutto simile a quanto osservato in una corte precedente di pazienti che ricevono un trapianto di isole dopo trapianto di rene. Al contrario, il secondo trapianto di isole nei pazienti trattati secondo Edmonton è estremamente efficiente inducendo una immediata insulino indipendenza. Questi dati suggeriscono che il pre trattamento con Rapamicina può favorire l’engrafment ed inibire l’infiammazione, che si osserva dopo l’infusione di isole nel fegato. Proponiamo quindi che un pre trattamento con Rapamicina venga eseguito in pazienti prima di ricevere il trapianto di isole.
PRECEDENTI ESPERIENZE E RISULTATI RAGGIUNTI NEL SETTORE.
A Produzione di isole
Durante il 2003 sono stati offerti 100 pancreas al programma trapianti, attraverso il N.I.Tp. 87 pancreas sono stati sottoposti ad isolamento di isole. 10 isolamenti sono stati considerati proponibili per trapianto di isole in termini di qualità e quantità.
Durante questo anno sono state portate avanti le seguenti ricerche, con lo scopo di identificare i parametri che migliorino l’isolamento di isole:
A1 caratterizzazione mediante HPLC dei lotti di liberasi utilizzati per isolamento delle isole.
A2 isolamento di isole per allotrapianto: studio delle variabili associate con il successo del trapianto.
Una analisi univariata ha mostrato che gli isolamenti superiori alle 250.000 isole equivalenti, con una purezza superiore al 20%, sono stati significativamente correlati con l’età del donatore, con il BMI, con il peso del pancreas e con la presenza di infiltrati grassi nella ghiandola.
2 – L’IMPATTO DEL TRAPIANTO DI ISOLE SULLA FISIOLOGIA MIOCARDICA.
INNERVAZIONE DEL MIOCARDIO. Una neuropatia diabetica autonomica è una complicanza comune del diabete, presente in circa il 40% dei pazienti insulino dipendenti. La presenza di una neuropatia autonomica e’ stata ipotizzata come causa della morte cardiaca improvvisa nei pazienti diabetici. L’assenza di variabilità alla frequenza cardiaca, secondaria alla neuropatia autonomica, è predittiva sia di una disfuzione ventricolare sinistra che di un incremento di mortalità. La funzione ventricolare sinistra risulta ridotta nel 59% dei pazienti diabetici con una neuropatia autonomica, rispetto al 8% in pazienti senza neuropatia autonomica. Inoltre, l’ipereccitabilita simpatica potrebbe promuovere alterazioni locoregionali della perfusione cardiaca. E’ possibile che il recupero dell’euglicemia possa indurre una reinnervazione del tessuto miocardico che induca un riequilibrio degli stimoli simpatici.
RISERVA CORONARICA
La microcircolazione coronarica è un letto vascolare dinamico che risponde, attraverso modifiche della resistenza arteriolare, alle richieste metaboliche dei tessuti. La funzione endoteliale e gli stimoli adrenergici possono modulare l’attività vaso-motoria delle coronarie ed il conseguente flusso ematico del miocardio, sia a riposo che durante le normali attività della vita quotidiana. Il flusso miocardico può essere quantizzato attraverso la PET con (13N) ammonio, un modello che consente lo studio della resistenza vascolare a livello cardiaco. Il flusso miocardico durante l’iperemia risulta essere del 22% più basso nei pazienti affetti da diabete mellito insulino dipendente di tipo I, confrontati con soggetti normali. L’alterazione della reattività vascolare coronarica nei pazienti diabetici può rappresentare il primo precursore di una conseguente coronaropatia, e può contribuire alla patogenesi della cardiomiopatia diabetica. Ci sono numerose evidenze che l’endotelio arteriolare è un importante modulatore della vasodilatazione coronarica. Il diabete causa un’alterazione della dilatazione arteriolare endotelio-dipendente, sia a livello coronarico che a livello arterioso generale. Un altro fattore che può contribuire all’alterazione del flusso ematico miocardico è l’alterata attività simpatica. E’ possibile che pazienti con neuropatia autonomica abbiano una maggior presenza di arteriosclerosi coronarica rispetto a quelli che non presentano neuropatia autonomica. In questi pazienti un’alterata vasodilatazione coronarica, dovuta agli effetti cardiaci della disfunzione endoteliale può contribuire alla patogenosi dell’ischemica miocardica ed alla conseguente disfuzione ventricolare.
3 -RIVASCOLARIZZAZIONE DELLE ISOLE PANCREATICHE TRAPIANTATE E LORO POTENZIALE PROLIFERAZIONE
3A – RIVASCOLARIZZAZIONE
La rigenerazione e riparazione dell’endotelio è stata sempre classicamente vista come risultato della migrazione e proliferazione di cellule endoteliali dall’endotelio adiacente. In realtà, questo meccanismo non costituisce l’unico sistema di riparazione. Cellule endoteliali progenitrici circolanti (EPCs) derivate dal midollo osseo ed esprimenti caratteristiche fenotipiche proprie dell’endotelio sono capaci di localizzarsi nei siti di danno dei vasi e di incorporarsi nell’endotelio nascente. Questo evento è recentemente stato osservato nei trapianti di organi solidi. Infatti, un elevato tasso di microchimerismo vascolare con progenitori endoteliali e muscolari lisci circolanti del ricevente è stato osservato nei tessuti di cuore trapiantato. L’interesse sta nel fatto che le EPCs derivate dal sangue periferico possono essere espanse ex vivo e possiedono caratteristiche di elevata proliferazione ed angiogenesi che possono essere sfruttate per la neovascolarizzazione terapeutica. Abbiamo recentemente dimostrato che le EPCs derivate dal sangue ed espanse ex vivo, esprimono il recettore di adesione L-selectin che regola la loro localizzazione nei tessuti che esprimono i sui ligandi. Tali ligandi sono rappresentati da diversi recettori costitutivi endoteliali che necessitano di appropriata glicosilazione da parte di fucosiltransferasi per interagire con L-selectin. Le fucosiltransferasi sono espresse da alcuni tipi di endotelio quale quello delle venule dei linfonodi, dei tessuti attivati e, nostra osservazione, dalle cellule di endotelio insulare umano immortalizzate.
Questi risultati aprono nuove prospettive in uno scenario dove queste cellule vengano isolate dal sangue periferico dei pazienti, espanse ex vivo, criopreservate e, quando necessario, impiantate nei siti di rivascolarizzazione come trapianto autologo. La nostra ipotesi centrale è che questa strategia possa essere estesa come supporto ai trapianti cellulari, come il trapianto di insule pancreatiche, per co-impiantare il tessuto endocrino insieme a EPCs autologhe precedentemente preparate al fine di generare immediata ed abbondante rivascolarizzazione.
3B – PROLIFERAZIONE
Le isole sono altamente vascolarizzate in vivo dove sono esposte all’ossigeno trasportato dalle arterie. Quando vengono rimosse dal pancreas i capillari fra le isole collassano e l’apporto di ossigeno dipende dalla diffusione del gas nello mezzo circostante. Piu’ volte si e’ osservata una necrosi centralizzata nell’isola pancreatica dovuta alla scarsa ossigenazione. L’utilizzo della spettroscopia NMR degli atomi 31P, 13C ed 1H che permette di monitorare la bioenergetica cellulare, il metabolismo e lo stato di ossigenazione e’ stato determinante per monitorare la vitalita’ di una gran varieta’ di tipi cellulari, incluse le beta cellule. Sia durante la vita fetale che nell’adulto, sembra esistere una riserva di beta-cellule staminali, che darebbero luogo alla formazione di nuove isole (“neogenesi delle isole”). I precursori cellulari che darebbero origine a queste nuove isole risiederebbero nel dotto pancreatico, dal dotto principale fino alle piccole ramificazioni o nelle isole del Langerhans. Alcuni dati in letteratura evidenziano che queste isole derivate dalle cellule staminali anche se non vengono incapsulate sono meno suscettibili all’attacco autoimmunitario per la loro ridotta antigenicita’.
4 – EFFETTO DELLE ALTERAZIONI DEI MECCANISMI APOPTOTICI SULL’ IMMUNITÀ CELLULA MEDIATA NEL DIABETE MELLITO TIPO 1: POTENZIALI APPLICAZIONI AL TRAPIANTO DI ISOLE
La morte cellulare programmata indotta da attivazione ha un’importante funzione nel mantenimento dell’immunità e nella modulazione della risposta infiammatoria. E’ stato dimostrato che la somministrazione di IL12 induce la differenziazione in senso Th1 di linfociti T ed accelera la comparsa di diabete autoimmune in topi NOD, infatti le interleuchine 4 e 12 influenzano la risposta immune e la formazione delle sottopopolazioni Th1 e Th2. L’interleuchina 12 promuove lo sviluppo dei Th1 e stimola la produzione di IFN g. IFN g sembra giocare un ruolo nello sviluppo di T1DM, come dimostrato dalla prevenzione della malattia in seguito alla somministrazione di anticorpi monoclonali anti-IFN g in topi NOD o dalla induzione di T1DM in topo esprimenti geni che codificano per IFN g sotto il controllo del promotore per l’insulina.
Recentemente è stato evidenziato un polimorfismo genetico in citochine e geni metabolici quali markers della suscettibilità a sviluppare T1DM.
L’analisi della produzione di citochine da parte di cellule infiltranti le insule pancreatiche mostra una correlazione tra la distruzione delle insule stesse e la produzione di IFN g, ciò è drammaticamente evidente in seguito alla somministrazione di IL-12.
E’ stato dimostrato che l’apoptosi attivata da NO in Th 1 (piuttosto che in Th 2) è regolata a livello intracellulare dal metabolismo del glutatione.
L’eliminazione preferenziale delle cellule Th 1 umane NO-indotta può selezionare cellule Th 2 e contribuire alla disregolazione del Sistema Immune inducendo così una selettiva e persistente soppressione della produzione di IFN g. I dati di letteratura riportati indicano la possibilità di modulare l’influenza Th1 nella risposta infiammatoria e nello sviluppo del diabete mellito autoimmune.
5 – XENOTRAPIANTO
Vi sono due fattori limitanti sul cammino dei trapianti di insule che giustificano la definizione di “work in progress” :
1. Ridotta disponibilità di pancreas umani.
2. Necessità di immunosopprimere farmacologicamente i riceventi, con i pesanti rischi che ciò comporta nel tempo, soprattutto se, secondo Edmonton, in trapianto si esegue in pazienti con T1DM che non necessitano del trapianto di altri organi.
Entrambi i problemi, ben riconosciuti dalla comunità scientifica internazionale, sono stati affrontati dal nostro laboratorio nel corso degli ultimi 15 anni. (1), mediante lo sviluppo di tecnologie per la separazione e purificazione di insule suine (adulte e neonate), la cui funzione è assai simile a quella della controparte umana. (2), mediante la generazione di tecnologie per la fabbricazione di microcapsule immunoprotettive, costituite dal alginato di sodio e poliaminoacidi, in grado di avvolgere ciascuna insula, inibendo il rigetto immunitario del tessuto insulare trapiantato senza dover ricorrere all’immunosoppressione farmacologica generalizzata dei riceventi. I risultati ottenuti in numerosi modelli animali di T1DM hanno chiaramente dimostrato la validità sia delle insule suine che delle microcapsule nel formare insieme un sistema in grado di indurre e sostenere la remissione della sindrome iperglicemica del T1DM. In avvicinamento all’uomo, ed in attesa che l’impiego di insule eterologhe suine sia consentito nell’uomo da parte delle autorità sanitarie internazionali, abbiamo perseguito e raggiunto livelli di “biosafety” per la purificazione dei polimeri capsulari, riconosciuti a livello internazionale (Nature Med., 2003) nonché dall’Istituto Superiore di Sanità. Quest’ultimo ha approvato, sul finire dello scorso anno, l’esecuzione da parte del nostro Centro di un trial clinico pilota su 10 pazienti con T1DM che riceveranno trapianti endoperitoneali di insule umane microincapsulate senza immunosoppressione farmacologica.
La competenza specifica del gruppo e’ supportata dai papers pubblicati su questo argomento negli ultimi 3 anni:
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E. La Rocca, et al Kidney International, 60: 1964-1971
E La Rocca, et alCurrent Opinion in Organ Transplantation, 6: 199-204
E Bosi, et alDiabetes, 50: 2464-2471
G. Luca, Trans. Proc., New York, 33, 681-682, 2001.
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