Trapianto di cellule staminali mesenchimali in un modello preclinico di trapianto allogenico di isole pancreatiche.

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco MOSCA Università di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il trapianto di isole pancreatiche (PIT), con tecniche chirurgiche mininvasive, offre un’alternativa promettente al trapianto di pancreas solitario per i pazienti colpiti da diabete tipo I. Sebbene sia risultata una procedura di successo in modelli sperimentali di animali diabetici, attualmente i risultati nell’uomo non sono ancora ottimali. Rimangono ancora molti ostacoli da superare prima di poterlo introdurre come alternativa valida per la cura del diabete tipo I nell’uomo.

In primo luogo la terapia immunosoppressiva, oltre ad aumentare il rischio di infezioni e di sviluppare tumori, può essere un fattore di rischio anche per lo sviluppo del diabete post-trapianto. Inoltre, il diabete di tipo 1 (IDDM) nell’uomo è spesso associato ad una risposta autoimmune verso gli antigeni delle cellule beta del pancreas, che può portare anche alla distruzione delle isole trapiantate. Infine, in accordo con il protocollo di Edmonton, l’indipendenza dall’insulina esogena nell’uomo può essere raggiunta solo con il trapianto di un numero sufficiente di isole, di solito provenienti da due o tre pancreas, tali da garantire un livello fisiologico di insulina.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule multipotenti presenti nella linea stromale del midollo osseo. E’ stato recentemente osservato che le MSC, derivate dal midollo osseo hanno la capacità immunomodulatoria di ridurre l’incidenza e la gravità del graft-versus-host disease durante il trapianto allogenico. Inoltre le MSC umane alterano in vitro il profilo della secrezione citochinica delle cellule dendritiche (DCs), quello delle cellule T helper (TH1) ed effettrici (TH2) e stimolano le cellule natural killer verso un fenotipo maggiormente antinfiammatorio e tollerante. La somministrazione in vivo di MSC porta anche a prolungare la sopravvivenza del trapianto di cute e la soppressione linfocitaria in modelli sperimentali.

Il nostro obiettivo è valutare, in un modello sperimentale animale, le proprietà immunosoppressive delle MSC nel trapianto di isole pancreatiche. Qui di seguito saranno descritte le principali tematiche affrontate da questo progetto e la strategia adottata per il conseguimento dei risultati:
1) Verrà studiata la capacità delle MSC di sopprimere localmente la risposta immunitaria nel trapianto di isole allogeniche, con l’obiettivo di evitare una terapia immunosoppressiva sistemica a lungo termine. A questo scopo, ratti diabetici verranno sottoposti a trapianto intraportale di isole pancreatiche con o senza trapianto contemporaneo di MSC.
2) Verrà studiata la capacità delle MSC di sopprimere la risposta autoimmune del diabete di tipo 1 che colpisce le isole pancreatiche trapiantate allogeniche e singeniche. In un modello animale di diabete autoimmune verranno eseguiti trapianti di isole pancreatiche allogeniche e singeniche insieme con le MSC.
3) Verrà studiato il ruolo di fattori capaci di influenzare la funzionalità delle isole, ovvero la vascolarizzazione e l’iperglicemia. L’iperglicemia, tipica condizione associata al trapianto di marginal-mass di isole pancreatiche, può essere responsabile dell’alterata funzionalità delle cellule beta. La popolazione in studio comprenderà trattamenti di insulina dopo trapianto allo- e singenico di marginal-mass di isole pancreatiche.

Nel pancreas normale, le isole hanno una microvascolarizzazione molto caratteristica (sistema insulo-acino portale), che viene distrutta in conseguenza all’isolamento e al trapianto delle isole stesse. Una rapida rivascolarizzazione, anche tramite processi di angiogenesi, è indispensabile per la sopravvivenza ed il corretto funzionamento delle isole dopo il trapianto. Un ruolo terapeutico potenziale può essere espletato dai progenitori delle cellule endoteliali (EPC), derivanti dal midollo osseo, nell’indurre la rivascolarizzazione delle isole e quindi l’attecchimento del trapianto.

L’effetto della vascolarizzazione delle isole verrà studiato in un modello di ratto diabetico trapiantato con isole allogeniche, MSC e con o senza progenitori di cellule endoteliali.

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il diabete mellito è una patologia che colpisce l’1-2% della popolazione, associata ad una alta morbidità e mortalità.

Il diabete di tipo 1 (IDDM), colpisce persone al di sotto dei 40 anni e determina una distruzione autoimmune delle cellule beta secernenti insulina delle isole di Langerhans.

Il diabete di tipo 2 (NIDDM), colpisce invece soggetti generalmente al di sopra dei 40 anni ed è causato da una resistenza cellulare al glucosio, non legata a processi immuni.

Entrambi i tipi di diabete richiedono una terapia insulinica, più o meno consistente, al fine di prevenire la morte da iperglicemia dovuta alla mancanza di secrezione insulinica.

Il diabete anche sotto terapia insulinica può determinare complicazioni a livello visivo, disfunzioni renali e neuropatie. Inoltre, dopo il fumo, è la principale causa di disagi vascolari aterosclerotici, che possono comportare problemi cardiaci o infarti, ma può anche richiedere amputazioni invalidanti.
La mortalità e morbidità associate al diabete sono dovute allo scarso controllo dei valori glicemici fisiologici.

Il trapianto di pancreas, da solo o in combinazione con il trapianto di rene, rappresenta attualmente l’approccio terapeutico migliore per i pazienti colpiti da diabete di tipo 1, dal momento che permette di ottenere un miglior controllo glicemico.
I dati dell’ International Pancreas Transplant Registry (fino all’agosto 2001) indicano che sono stati effettuati almeno 16.000 trapianti di pancreas, di cui circa il 70% sono trapianti simultanei rene-pancreas, il 25% trapianti di pancreas dopo quello di rene e i rimanenti trapianti del solo pancreas.

In Italia, il trapianto di pancreas sta suscitando una crescente attenzione: il numero dei pazienti trattati con queste procedure di trapianto è stato di 35 nel 1999, di circa 40 nel 2000 e più di 70 nel 2001. Molti aspetti del trapianto di pancreas sono ancora da migliorare, incluso lo stato del ricevente (dialisi pre-impianto), il ruolo delle procedure chirurgiche (circolo sistemico o portale, combinato o solitario), la scelta dell’immunosoppressione e l’impatto dei fattori immunologici, metabolici e genetici sulla sopravvivenza e sulla funzionalità del trapianto.

L’alternativa al trapianto del tessuto pancreatico vascolarizzato è il trapianto di isole pancreatiche, che è risultata una procedura di successo in modelli sperimentali di animali diabetici.
Attualmente i risultati nell’uomo non sono ancora ottimali. Come sarà discusso di seguito, rimangono ancora molti ostacoli da superare prima di poter effettuare con successo il trapianto di isole pancreatiche nell’uomo.

Ci sono quattro importanti fattori da considerare per ottimizzare il trapianto di isole pancreatiche.

Per primo, la conservazione a freddo del pancreas prima dell’isolamento delle isole dovrebbe essere inferiore ad otto ore. Secondo, dovrebbe essere trapiantato un numero minimo di 6000 IE/Kg per peso del ricevente (dove IE indica gli equivalenti di isole: una espressione del volume delle isole, convertito nel numero di isole con un diametro di 150 micrometri).

Un pancreas umano contiene una media tra 300.000 e 1,5 milioni di isole pancreatiche ed è stato valutato che solo il 60% di queste è necessaria per mantenere un normale metabolismo glucidico.
Malgrado questo, sono usualmente necessarie isole pancreatiche derivate da diversi donatori per ottenere una indipendenza insulinica e solo raramente si ottiene il solito risultato prelevando le isole da un singolo donatore.

Un terzo aspetto di notevole importanza è la somministrazione di anticorpi antilinfocitari (globuline antilinfocitarie (ALG) o globuline antitimociti (ATG)) al momento del trapianto di isole pancreatiche.
Questi anticorpi mono- o policlonali sono efficaci nell’indurre una deplezione linfocitaria.

Infine come quarto aspetto si deve considerare che il fegato è il sito preferito per il trapianto. Oltre la limitata disponibilità delle isole pancreatiche umane, ci sono altri problemi irrisolti, come gli effetti avversi degli attuali protocolli immunosoppressivi, la recidiva dei processi autoimmuni legati al diabete di tipo 1, i malfunzionamenti ed i processi ischemici che possono colpire le isole stesse.
I farmaci immunosoppressivi sono necessari per prevenire le reazioni di rigetto associate al trapianto, tuttavia, i protocolli immunosoppressivi basati sull’utilizzo di corticosteroidi, ciclosporina e tacrolimo (FK 506) sono lontani dal soddisfare pienamente il trapianto di isole in quanto l’utilizzo degli stessi farmaci può indurre il diabete.
Inoltre, essi comportano gravi effetti collaterali che precludono il loro impiego terapeutico in molti casi tranne che quando siano realmente indispensabili.

Nuove strategie immunosoppressive non prevedono l’impiego di steroidi, utilizzano bassi livelli di tacrolimo, micofenolato mofetile (MMF) e anticorpi antilinfocitari, ma queste sono ancora associate ad un aumentato rischio di infezioni e tumori maligni, inoltre comportano problemi di sviluppo e crescita in bambini e in giovani adulti.

Il malfunzionamento primario delle isole pancreatiche trapiantate nell’uomo è un evento abbastanza frequente.
Questo potrebbe essere il risultato di diversi fattori: (1) il trapianto di un numero inadeguato di isole; (2) fattori tecnici legati all’isolamento che riducono la vitalità e il funzionamento delle isole, così come l’ischemia calda o fredda dovuta a tecniche chirurgiche non ancora abbastanza rapide; (3) infiammazioni non specifiche che danneggiano le isole trapiantate; (4) distruzione mediata dal sistema immune. Nel pancreas normale, le isole hanno una microvascolarizzazione molto caratteristica: le arteriole si disperdono in capillari all’interno del centro dell’isola stessa, poi emergono attraverso la zona periferica dell’isola e si svuotano nel sistema portale (sistema insulo-acino portale).
Questo complicato sistema viene distrutto in conseguenza all’isolamento e al trapianto delle isole stesse.
Durante l’isolamento e la coltura delle isole, l’endotelio delle isole stesse perde il differenziamento e tende a degenerare. Una rapida rivascolarizzazione è quindi indispensabile per la sopravvivenza ed il corretto funzionamento delle isole dopo il trapianto.
Quindi la sopravvivenza delle isole trapiantate dipende in maniera significativa dalle cellule endoteliali e dai capillari che originano nell’organo impiantato da cui deriva il loro nuovo sistema vascolare.

E’ noto che i vasi sanguigni all’interno del trapianto si iniziano a visualizzare 3-5 giorni dopo il trapianto stesso, e che un riequilibrio del normale flusso sanguigno si instaura dopo 7-14 giorni dal trapianto. Il primo periodo ischemico danneggia notevolmente il centro delle isole, che contiene in larga parte cellule beta secernenti insulina.

E’ interessante tener presente che le isole pancreatiche intraepatiche vengono rivascolarizzate esclusivamente da diramazioni dell’arteria epatica.
A proposito del meccanismo di rivascolarizzazione delle isole, è stata osservata la formazione di vasi sanguigni da capillari preesistenti, ovvero un fenomeno di angiogenesi.

Un ruolo terapeutico potenziale è espletato dai progenitori delle cellule endoteliali (EPC), derivati dal midollo osseo, nell’indurre la rivascolarizzazione delle isole e quindi l’attecchimento del trapianto. Il reclutamento di questa popolazione di cellule staminali è stato riscontrato anche nelle lesioni di cellule beta pancreatiche.

Attualmente è noto il ruolo di alcune chemochine, come lo stromal derived factor 1 (SDF-1), nel reclutamento delle cellule staminali provenienti dal midollo osseo che sono in grado di potenziare l’angiogenesi postischemica. Inoltre, altre cellule staminali adulte possono giocare un ruolo importante in questi processi. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule multipotenti presenti nella linea stromale del midollo osseo. E’ stato recentemente osservato che le MSC, derivate dal midollo osseo hanno la capacità di ridurre l’incidenza e la gravità del GVHD durante il trapianto allogenico. Inoltre le MSC umane alterano il profilo della secrezione citochinica delle cellule dendritiche (DCs), quello delle cellule T helper (TH1) ed effettrici (TH2) e stimolano le cellule natural killer verso un fenotipo maggiormente antinfiammatorio e tollerante.

Queste interazioni tra MSC allogeniche e cellule immunitarie simulano meccanismi simili a quelli che in vivo inducono tolleranza mediata da MSC, che potrebbero svolgere un ruolo terapeutico per la riduzione di GVHD, per l’induzione di tolleranza e la modulazione dell’infiammazione. La somministrazione in vivo di MSC porta anche a prolungare la sopravvivenza del trapianto di cute e la soppressione linfocitaria in modelli sperimentali di babbuino. Il nostro obiettivo è valutare, in un modello sperimentale animale, le proprietà immunosoppressive delle MSC nel trapianto di isole pancreatiche